重组肝素酶 I制备低分子肝素寡糖技术

  

重组肝素酶 I制备低分子肝素寡糖技术

1 、项目简介

目前,肝素作为抗凝试剂和抗栓试剂已有 60多年的历史了,但是,由于肝素具有抗凝活性,所以大量的使用肝素会引起出血和诱导血小板减少、骨质疏松等副作用,从而大大的限制了肝素在临床上的应用。而低分子量肝素(LMWH)具有与高分子肝素同样的抗Xa因子(FXa)作用,而抗凝血酶(FIIa)活性大大降低,表现出抗血栓形成时对凝血系统影响小,因而在临床中得到广泛的应用[1]。与高分子肝素相比,LMWH还具有分子小,易吸收,生物利用度高,体内半衰期长等特点。目前,制备低分子肝素的方法主要有化学裂解法[2,3]和酶降解法[4]。虽然化学裂解法工艺流程较简单,但裂解过程中加入的强氧化剂会与肝素中的硫酸基团作用而引起肝素抗凝活性的降低,此外这种方法还可能引入毒物而污染环境,而酶降解法由于其温和的反应条件且无毒性易实现生产连续化而越来越得到人们的关注。目前,酶降解法中主要研究采用来自肝素黄杆菌( Flavobacterium heparinum )的肝素酶I来制备低分子肝素,因其产量低、纯化困难,造成酶的成本非常昂贵,限制了酶法制备低分子肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的途径,但通常的表达体产生的肝素酶I容易形成包涵体,无法直接利用。

本实验室前期从一株肝素黄杆菌中克隆得到肝素酶 I的基因,利用融合蛋白技术构建了高效生产可溶性的肝素酶I的基因工程菌株,实现了可溶肝素酶I的生产,获得了很高的酶活,是一种具有广泛应用前景的低成本生产肝素酶I的方法。随后,本实验室利用该重组肝素酶I,证明其能和商品肝素一样有效的降解肝素, 制备出理想的LMWH。通过控制酶解反应条件,可得到平均分子量在5000—6000的低分子量肝素寡糖。另外,利用膜生物反应器通过控制酶反应时间和酶量,可以制备出目前国际上备受关注超低分子量肝素(平均分子量2000-3000左右)。

本发明中所用到的重组肝素酶 I只需进行一步亲和层析就能达到95%的纯化效果, 同时利用融合蛋白的亲和吸附能力容易实现肝素酶 I的定向固定化,融合酶的稳定性高,使酶的反复使用成为可能,从而提高酶反应效率,降低酶的使用成本;从而降低低分子量肝素的生产成本。且摇瓶培养的酶活可以达到16000IU/L, 5L 发酵罐生产酶活达到了 20000IU/L以上. 所以由于该重组肝素酶I的生产、分离纯化和使用成本可以大幅度的降低,因此利用该融合蛋白生产具有理想平均分子量且分子量分布范围窄的低分子量肝素的方法具有巨大的工业应用价值。我国是肝素的生产大国,目前大部分肝素都用于出口,还没有具有自主知识产权的低分子肝素生产技术,目前低分子肝素药剂主要依赖国外进口。2005年国内低分子肝素的市场有5亿人民币左右,美国的市场额达到56亿美元左右,而且每年成递增趋势。因此开发清洁高效生产低分子肝素技术具有巨大的市场前景。

2、联系方式

项目负责人:邢新会

联系地址:清华大学化工系生物化工研究所,北京 100084

联系电话: 010-62794771 传真:010-62770304

E-mail : xhxing@tsinghua.edu.cn